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轉錄激活子樣效應因子核酸酶技術(TALENS)國內外研究現狀

時間:2019-06-21 19:53來源:畢業論文
轉錄激活子樣效應因子核酸酶技術(TALENS)是近年發展起來的一種新型基因敲除方法,其利用TALES蛋白核酸酶結合域氨基酸序列與其靶位點核酸序列之間存在著恒定對應關系,從而組裝出

轉錄激活子樣效應因子核酸酶技術(TALENS)是近年發展起來的一種新型基因敲除方法,其利用TALES蛋白核酸酶結合域氨基酸序列與其靶位點核酸序列之間存在著恒定對應關系,從而組裝出能特異性結合任意DNA序列的模塊化蛋白。TALENS技術以其快速、高效的優勢對生物基因研究領域產生深遠影響,為遺傳疾病治療提供了新的策略[1]。36506
TALENS技術作用機制與ZFNS[2]技術類似,它的核心是識別特異DNA序列的TALES蛋白和核酸內切酶FokI。TALES蛋白是黃單胞菌進入植物細胞改變基因序列后轉錄翻譯分泌的,由12個或以上特異性識別DNA序列的串聯“蛋白模塊”和N-端、C-端兩側序列組成。每個“蛋白模塊”有34個氨基酸組成,其中第12、13位點是靶向識別的關鍵,被稱為重復可變的雙連氨基酸(repeat variant di-residue,RVDS)位點。BOCH等首次提出核酸對應關系,即TALES蛋白上的每個RVDS僅能識別1個堿基,即NI識別A、NG識別T、NN識別G或A、HD識別C。之后又多次研究證明了這一關系。
AvrBs3[3]是最早研究TALE蛋白的,直到2009年的時候其特異識別DNA堿基的特性才首次得到應用。并在Science雜志上發表了這個研究應用。同年人們徹底搞清了TALE的識別規則,并且在隨后的2014年CELL雜志上發表了其特異識別的原理。而當TALE序列被完全解譯以后,其應用逐漸被人們所熟知,也開始進行研究。論文網
TAL效應蛋白目標域可用于直接催化FokⅠ核酸酶的結構域,作為融合蛋白,為了創建位點特異性DNA雙鏈缺口(DSBs)。由于FokⅠ的功能作為一個二聚體,在非同源末端連接(NHEJ)被切斷的染色體可能會不嚴密地結合,導致在斷裂部位小的插入或缺失,從而干擾基因功能。在同源重組(HR)中,該DNA周圍的缺口位點被類似序列的模板所修復。修復模板的序列可以在特定突變或額外序列中修改或修訂(DNA的編輯)。基于NHEJ和HR修改的基因組修飾在不同動物和植物物種中頻率很高,利用ZFN和工程化家族內切酶,后者移動的元素獲得的酶識別12~40個堿基對(bp)并且具有被改造的新DNA序列特異性。人們已經證明了在酵母質粒獲得目標物中TALEN的活性,利用在DNA識別序列報告基因中的2個重疊片段之間被替換的分析,如果目標被切開,隨后通過修復單鏈退火加入重疊片段并重新組成的報告基因,提供了一個TALEN活性的定量讀數。雖然TAL效應與隨機重復組裝排列已被證明其功能可作為轉錄活化劑與對應的合成靶序列,所述酵母的試驗證明即重復排列可定制針對感興趣的特定序列,在這種情況下基因序列來自擬南芥和斑馬魚[4]。 源`自*六:維.論^文'網www.aftnzs.live
  另一個里程碑是實現自定義的TALENs被證明通過NHEJ在位點定向誘變和在培養內源性染色體位點人胚腎細胞中通過HR基因打靶。NHEJ的突變效率高達25%,這些標準在ZFN中觀察到。由于這一具有里程碑意義獲得,TALENs已被成功地用于多種試驗系統。TALEN介導的基因打靶在人胚胎干細胞的5個位點和誘導多能性干細胞中被證明,再次與ZFNs效率 一樣。對于植物而言,TALENs卻顯示出了一個切割瞬時導入,游離目標在煙草葉片中,和NHEJ介導的位點定向誘變是在擬南芥原生質體中的一種內源性基因座中獲得的。在酵母中,TALENs啟用高效率的基因置換的幾個染色體位點。在秀麗隱桿線蟲和其親緣的C.briggsae,為此基因打靶方法還有所欠缺,TALEN或ZFN的mRNA注入性腺導致在內源靶基因中3%~5%的后代伴隨著突變。利用TALENs,體細胞和在斑馬魚中的遺傳基因敲除已被使用,并且IgM通過顯微注射胚胎TALEN DNA或mRNA的構建體敲除鼠已經產生[5]。
  2014年2月,北京大學生命科學學院魏文勝課題組依托于一種自主研發的TALE蛋白組裝技術完成了全部TALE元件的解碼工作[6]。 轉錄激活子樣效應因子核酸酶技術(TALENS)國內外研究現狀:http://www.aftnzs.live/yanjiu/20190621/34993.html
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