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人AAVS1位點的TALENS質粒構建及活性驗證

時間:2019-06-21 19:52來源:畢業論文
利用類轉錄激活子樣效應因子核酸酶(transcription activator -like (TAL) effector nucleases TALENS)技術構建具有活性的AAVS1的TALEN質粒

摘要:本實驗旨在利用類轉錄激活子樣效應因子核酸酶(transcription activator -like (TAL) effector nucleases TALENS)技術構建具有活性的AAVS1的TALEN質粒。根據TALEN設計原則和AAVS1的共同序列確定基因敲除的靶位點、TALEN識別序列和用于活性驗證的限制性酶切位點。利用質粒文庫快速構建TALEN質粒。通過氯化鈣法將質粒共轉入293T細胞,同時加入兩種常見的質粒轉染增強試劑氯喹和丁酸鈉, 以對比不同藥物對TALEN質粒活性的影響。結果顯示:兩種質粒轉染增強藥物對TALEN質粒活性的影響不顯著,推測原因一是通過T7E1酶切驗證活性不是一種很好的定量方法,二是未使用增強酶切活性的最佳藥物劑量及作用時間。36506
畢業論文關鍵詞:TALEN質粒;AAVS1;活性驗證;293T;氯喹;丁酸鈉
Construction and Activity Assay of Transcription Activator—like Effector Nuclease(TALEN)Plasmids for AAVS1
Abstract:The present study is designed to take advantage of transcription activator-like effector nucleases (transcription activator-like (TAL) effector nucleases TALENS) to constructing TALEN plasmid having the activity AAVS1. According to the common sequence TALEN design principles to determine the target site and AAVS1 knockout, TALEN recognition sequence and for active authentication restriction sites. Using plasmid library kit quickly build TALEN plasmid.By Calcium chloride method plasmids into 293T cells and add chloroquine and sodium butyrate to compare the effects of different drugs on the activity of the plasmid TALEN.The results showed that two plasmid vector to enhance the impact of drugs on TALEN activity was not significant. One reason speculation verified by T7E1 enzyme activity is not a good quantitative method, the second is not used to enhance the activity of enzyme optimal drug dose and duration of action.
Keywords: TALEN plasmid  AAVS1  Activity Assay 293T  Chloroquine  Sodium butyrate

源¥自%六^^維*論-文+網=www.aftnzs.live


  目錄
1 緒論    - 1 -
1.1 本課題的國內外研究進展    - 1 -
1.1.1 TALENS    - 1 -
1.2 AAVS1 位點    - 2 -
1.2 本課題的研究內容、目的及意義    - 3 -
1.2.1  TALENS    - 3 -
1.2.2  AAVS1    - 3 -
2 材料與方法    - 5 -
2.1 實驗材料    - 5 -
2.1.1 TALENS質粒構建    - 5 -
2.1.2活性驗證    - 5 -
2.2 實驗方法    - 5 -
2.2.1 TALENS質粒構建實驗流程:    - 5 -
(1) 人AAVS1 在基因組中的序列信息:    - 6 -
(2) 目的基因擴增    - 7 -
(3) PCR 擴增起始片段    - 8 -
(4) 用BbsI和BsaI-HF酶切獲得延伸片段和載體片段    - 8 -
(5) 準備預混合液    - 9 -
(6) 磁珠的準備    - 9 -
(7) 全長片段的制備    - 9 -
(8)表達載體線性化    - 10 -
(9)全長片段和線性化載體的連接    - 10 -
(10) 轉化    - 11 -
(11) 陽性克隆鑒定    - 11 -
(12) 質粒抽提    - 11 -
2.2.2 活性驗證    - 11 -
(1 )TALENs細胞樣品的準備:    - 11 -
(2) PCR    - 12 -
(3)  T7E1活性分析實驗-退火    - 12 -
(4)  T7E1活性分析實驗-酶切    - 12 -
(5)  T7E1活性分析實驗-DNA PAGE電泳,染色    - 12 -
3 結果與討論    - 13 - 源¥自%六^^維*論-文+網=www.aftnzs.live
3.1起始片段的制備結果    - 13 -
3.2 延伸片段和終止片段制備結果    - 13 -
3.3.菌落PCR鑒定陽性克隆    - 14 - 人AAVS1位點的TALENS質粒構建及活性驗證:http://www.aftnzs.live/shengwu/20190621/34992.html
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